ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОМ КОНФОКАЛЬНОЙ МИКРОСПЕКТРОСКОПИИ НАКОПЛЕНИЯ, ЛОКАЛИЗАЦИИ И УДЕРЖАНИЯ В КЛЕТКАХ 3-ДЕЗВИНИЛ-3-ФОРМИЛХЛОРИНА Р6
Феофанов А. В., Гришин А. И., Шитова Л. А., Куделина И. А., Кармакова Т. А., Якубовская Р. И., Миронов А. Ф., Эгрет-Шарлье М., Вини П.
1 Институт биоорганической химии им. М. М.Шемякина и Ю. А.Овчинникова РАН, 117871 Москва; *Московский НИИ им. П. А. Герцена, 125284 Москва; **Государственная академия тонких химических технологий им. М.В.Ломоносова, 117571 Москва; ***Centre de Biophysique
Метод конфокальной микроспектроскопии
и реконструкции спектральных изображений (КОМИРСИ) основан на
измерении двумерного набора внутриклеточных спектров флуоресценции
противоопухолевых агентов с трехмерным пространственным разрешением.
Анализ этих спектров позволяет охарактеризовать состояние противоопухолевых
соединений в клетке, идентифицировать образование их комплексов
с макромолекулами и реконструировать карты количественного внутриклеточного
распределения агентов. 3-Дезвинил-3-формилхлорин р6 (ФХр6) -
фотосенсибилизатор, перспективный для фотодинамической терапии
рака. По данным модельных экспериментов в растворе при нейтральных
рН ФХр6 характеризуется максимумом флуоресценции (lмакс)
698 нм и при концентрации больше 5 мкмоль/л образует димеры (lмакс
= 664 нм). Уменьшение рН раствора до 5,5, а также образование
комплексов ФХр6 с белками и модельными мембранами приводит к диссоциации
димеров. ФХр6 комплексов с ДНК не образует. Исследование методом
КОМИРСИ фармакокинетики ФХр6 в живых клетках аденокарциномы легкого
человека А549 показывает, что ФХр6 быстро в течение 10 мин проникает
в клетки. Через 1 ч скорость накопления ФХр6 значительно снижается,
и в последующие 6 ч идет медленный рост внутриклеточной концентрации
агента, достигающей 70% от концентрации агента во внешней среде.
ФХр6 накапливается в цитоплазме, где в отдельных областях его
концентрация в 2 раза больше концентрации агента в культуральной
среде. Концентрация ФХр6 в околоядерной области (по-видимому,
в митохондриях) в 3-4 раза больше, чем на периферии. В ядре его
концентрация в 8-10 раз меньше, чем в цитоплазме. Спектральный
анализ показывает, что в клетках ФХр6 находится преимущественно
в мономерной форме в комплексах с белками и/или мембранными структурами
(lмакс=702 нм). Димеры составляют незначительную долю
внутриклеточного ФХр6, локализованы главным образом в цитоплазме,
и их распределение повторяет распределение мономерного ФХр6. В
ядре ФХр6 связан с белками. ФХр6 быстро выводится из клеток. Через
30 минут после удаления ФХр6 из среды концентрация агента в клетках
уменьшается в 5 раз, а через 2 ч - в 16 раз. Удерживаемый в клетках
ФХр6 находится в комплексах с белками и мембранами, а его относительное
внутриклеточное распределение остается прежним.