ХАРАКТЕРИСТИКА КОНФОРМАЦИОННЫХ СОСТОЯНИЙ ОЛИГОМЕРНОГО ПОРООБРАЗУЮЩЕГО БЕЛКА ИЗ Yersinia pseudotuberculosis. ВЛИЯНИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА НА СТАБИЛЬНОСТЬ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ПОРИНА

Новикова О. Д., Соловьева Т. Ф.
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, 690022 Владивосток
Настоящая работа посвящена исследованию конформационных изменений и функциональной активности порина из Yersinia pseudotuberculosis в результате отделения связанного ЛПС. Методами кругового дихроизма (КД), УФ-спектроскопии и собственной белковой флуоресценции охарактеризованы пространственная организация ЛПС-содержащего порина (ПОРлпс) и порина, очищенного от ЛПС (ПОР). Методом реконструкции в бислойные липидные мембраны (БЛМ) проведено сравнительное изучение их порообразующей активности. Очистка белка от связанного ЛПС приводит к значительным изменениям в пространственной организации тримера порина. На уровне третичной структуры белка наблюдается уменьшение передачи энергии возбуждения флуоресценции от тирозина к триптофану и увеличение доли остатков триптофана, экранированных от поверхности белковой глобулы. Как показали расчеты элементов вторичной структуры (по данным спектров КД), удаление ЛПС аналогично уменьшению концентрации детергента в растворе белка. В обоих случаях наблюдается увеличение суммарной доли b-структуры. Очищенный от ЛПС порин представляет собой полностью b-структурированный белок, отличающийся от ПОРлпс большей конформационной нестабильностью и склонностью к агрегации. Способность поринов НМ грамотрицательных бактерий к образованию b-структурированных конформационных интермедиатов обсуждается в связи с механизмом структурных перестроек, характерных для белков-прионов, критического фактора некоторых нейродегенеративных расстройств. Высказано предположение о конформационной пластичности порообразующих белков и о существовании общих закономерностей в процессе образования b-структурированных агрегатов поринов и денатурированных изоформ прионов - амилоидов. Для выяснения роли ЛПС в проявлении порином функциональной активности проведено сравнительное изучение порообразующих свойств четырех образцов: ПОРлпс, ПОР, (ПОР+ЛПС) и (ПОР+ОГ). Анализ флуктуаций тока показал, что ПОРлпс и ПОР отличаются по эффективности и характеру встраивания в БЛМ. Удаление ЛПС приводит к увеличению действующей концентрации белка на два порядка, характер распределения пор указывает на увеличение кооперативности работы каналов, что согласуется с данными УФ-спектроскопии об увеличении агрегации белка. По-видимому, необходимым условием для реконструкции порина в липидный бислой является наличие у белка так называемой функционально-активной конформации. Роль промотора в процессе приобретения порином этой конформации в нативной мембране выполняет ЛПС, который in vitro может быть с успехом заменен на неионный детергент, в данном случае октилглюкозид (ОГ).