ХАРАКТЕРИСТИКА КОНФОРМАЦИОННЫХ СОСТОЯНИЙ ОЛИГОМЕРНОГО ПОРООБРАЗУЮЩЕГО БЕЛКА ИЗ Yersinia pseudotuberculosis. ВЛИЯНИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА НА СТАБИЛЬНОСТЬ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ПОРИНА
Новикова О. Д., Соловьева Т. Ф.
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, 690022 Владивосток
Настоящая работа посвящена
исследованию конформационных изменений и функциональной активности
порина из Yersinia pseudotuberculosis в результате отделения
связанного ЛПС. Методами кругового дихроизма (КД), УФ-спектроскопии
и собственной белковой флуоресценции охарактеризованы пространственная
организация ЛПС-содержащего порина (ПОРлпс) и порина,
очищенного от ЛПС (ПОР). Методом реконструкции в бислойные липидные
мембраны (БЛМ) проведено сравнительное изучение их порообразующей
активности. Очистка белка от связанного ЛПС приводит к значительным
изменениям в пространственной организации тримера порина. На уровне
третичной структуры белка наблюдается уменьшение передачи энергии
возбуждения флуоресценции от тирозина к триптофану и увеличение
доли остатков триптофана, экранированных от поверхности белковой
глобулы. Как показали расчеты элементов вторичной структуры (по
данным спектров КД), удаление ЛПС аналогично уменьшению концентрации
детергента в растворе белка. В обоих случаях наблюдается увеличение
суммарной доли b-структуры. Очищенный от ЛПС порин представляет
собой полностью b-структурированный белок, отличающийся от ПОРлпс
большей конформационной нестабильностью и склонностью к агрегации.
Способность поринов НМ грамотрицательных бактерий к образованию
b-структурированных конформационных интермедиатов обсуждается
в связи с механизмом структурных перестроек, характерных для белков-прионов,
критического фактора некоторых нейродегенеративных расстройств.
Высказано предположение о конформационной пластичности порообразующих
белков и о существовании общих закономерностей в процессе образования
b-структурированных агрегатов поринов и денатурированных изоформ
прионов - амилоидов. Для выяснения роли ЛПС в проявлении
порином функциональной активности проведено сравнительное изучение
порообразующих свойств четырех образцов: ПОРлпс, ПОР,
(ПОР+ЛПС) и (ПОР+ОГ). Анализ флуктуаций тока показал, что ПОРлпс
и ПОР отличаются по эффективности и характеру встраивания в БЛМ.
Удаление ЛПС приводит к увеличению действующей концентрации белка
на два порядка, характер распределения пор указывает на увеличение
кооперативности работы каналов, что согласуется с данными УФ-спектроскопии
об увеличении агрегации белка. По-видимому,
необходимым условием для реконструкции порина в липидный бислой
является наличие у белка так называемой функционально-активной
конформации. Роль промотора в процессе приобретения порином этой
конформации в нативной мембране выполняет ЛПС, который in vitro
может быть с успехом заменен на неионный детергент, в данном случае
октилглюкозид (ОГ).