ЗАМЕДЛЕННАЯ ДИФФУЗИЯ ОПРЕДЕЛЯЕТ КИНЕТИКУ ГИБРИДИЗАЦИИ ДНК С ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ, ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ В ГЕЛЕ

Лившиц М. А., Мирзабеков А. Д.
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 117984 Москва
В связи с разработкой гибридизационного метода секвенирования ДНК возникла необходимость в теоретическом анализе физико-химических особенностей процессов связывания и диссоциации ДНК на олигонуклеотидном микрочипе. Микрочип содержит множество отдельных полиакриламидных ячеек (размером, напр., 100х100х20 мкм3), в каждой из которых химически закреплено определенное количество одного из 4L олигонуклеотидов длины L. Гибридизация регистрируется по связыванию в ячейках микрочипа флуоресцентно-меченой ДНК. Послегибридизационное считывание информации может проводиться в разных режимах - либо по достигнутым уровням заполнения ячеек меченой ДНК, либо по изменению (равновесных) уровней заполнения при медленном повышении температуры (кривые плавления), либо по кинетике выхода меченой ДНК (отмывка) при постоянной температуре или при нагревании. Оптимизация условий гибридизации и считывания информации (с точки зрения дискриминации совершенных дуплексов от дуплексов с мисматчами) является целью теоретического анализа. "Химические" характерные времена для реакций образования и распада дуплексов используемой длины (например, L=8) и характерное время диффузии ДНК вглубь гибридизационной ячейки существенно короче времен, характерных для реальных процессов гибридизации и отмывки. Наблюдаемое время выхода ДНК при отмывке тем продолжительнее, чем выше концентрация иммобилизованного олигонуклеотида, хотя кинетика диссоциации дуплексов (реакции первого порядка) не может зависеть от концентрации. Анализ показал, что кинетика гибридизации ДНК с иммобилизованными в геле олигонуклеотидами и кинетика высвобождения ДНК из гибридизационного геля определяются особым типом молекулярного движения в среде, содержащей неподвижные связывающие центры. Диффузионное движение, прерываемое актами связывания и возобновляющееся после диссоциации, мы назвали "замедленной диффузией". Характерное время такого движения помимо времени диффузии пропорционально константе связывания и концентрации связывающих центров. Вследствие этого гибридизация особенно медленна в ячейках, где образуются совершенные, наиболее прочные дуплексы. Дискриминация совершенный/мисматчевый непосредственно по результатам гибридизации может быть ухудшена, если процедура гибридизации недостаточно продолжительна для завершения процесса в "совершенных ячейках". Нежелательны избыточные концентрации ДНК, т.к. с приближением к насыщению исчезает разница в заполнении совершенных и мисматчевых ячеек. Низкие температуры предпочтительны, поскольку увеличивают разницу между совершенным и мисматчевым связыванием. Кинетические различия между совершенными и мисматчевыми дуплексами дают огромные возможности для улучшения дискриминации. Послегибридизационная отмывка подходящей длительности может, почти не меняя уровней сигналов от ячеек с совершенными дуплексами, резко снизить сигналы от мисматчевых ячеек. Авторы благодарят ГНТП РФ "Геном человека" и DOE USA за финансовую поддержку исследований.