КООПЕРАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ В ИЗОЛИРОВАННОЙ МИТОХОНДРИИ
Тычинский В., Ягужинский Л., Вайсс Д.
Московский институт радиотехники, электроники и автоматики, 117454 Москва; НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, 119899 Москва; Центр микроскопии Университета г. Росток, Д-1805 Германия
Кооперативные процессы,
являющиеся физическим базисом, определяющим пространственно-временную
организацию жизни на клеточном уровне, в ряде случаев удавалось
наблюдать на макромолекулярном уровне. В работе методом Динамической
Фазовой Микроскопии были исследованы флуктуации оптических параметров,
сопровождающих ферментативную активность в изолированных нативных
митохондриях печени крысы in vitro. В спектрах флуктуаций
были обнаружены компоненты с доминирующими частотами порядка единиц
Герц и пространственной протяженностью, близкой к поперечному
размеру митохондрий, а также дельта-коррелированные во времени
компоненты с малыми (около 200 нм) радиусами корреляции. Измерения
фазовой высоты профиля митохондрии h(x), где х - координата
вдоль линии сканирования, производились вдоль произвольно выбранной
линии в плоскости фазового изображения. При поперечном размере
около 700 нм максимальная фазовая высота профиля не превышала
hm=50 нм, что в предположении о сферической
форме митохондрии дает максимальное значение разности эффективных
показателей преломления внутренней и внешней сред Dn =
0,07. Вследствие происходящих в митохондрии процессов фазовая
высота изменялась во времени и дисперсия этих временных флуктуаций
высоты являлась количественной характеристикой интенсивности флуктуаций
I(x). Распределение интенсивности флуктуаций I(x)
по диаметру было неравномерно и по ее максимальному значению Im"15
нм2 можно было оценить средне-квадратичную амплитуду
флуктуаций Im1/2"4 нм. Спектральный
анализ флуктуаций показал наличие доминирующих компонент с частотами
в интервале 1-20 Гц. Некоторые из них имели протяженность вдоль
скан-линии до 600 нм, близкую к поперечному размеру митохондрии.
Наблюдались также интенсивные локальные компоненты с шириной 50
- 100 нм, близкой к пределу пространственного разрешения микроскопа.
Частота и интенсивность доминирующих компонент изменялись во времени
и это свидетельствовало о нестационарности процессов с характерным
временем порядка секунд. Всего были произведены измерения около
200 митохондрий. Нормальные и АТФ-стимулированные митохондрии
имели больший уровень интенсивности (5 - 20 нм2). Для проверки
гипотезы о связи флуктуаций с активностью ферментов в буфер добавлялись
АТФ, FCCP и ротенон). Специфическое действие вводимых в буфер
добавок и ингибиторов проявлялось в изменении интенсивности и
спектра флуктуаций. АТФ-стимуляция усиливала интенсивность и контраст
доминирующих компонент. Ротенон резко снижал Dn до уровня
"10-2 и превышение интенсивности над уровнем шумов
было в пределах точности измерений (0,2-0,5 нм2). Введение
разобщителя FCCP приводило к снижению Dn до значений 0,02 - 0,03,
падению интенсивности до 3-4 нм2 и к исчезновению контрастных
компонент в спектрах. Добавление АТФ к FCCP почти не влияло на
Dn и на общую интенсивность, но восстанавливало контрастные
компоненты. Однородный, характерный для d-коррелированных процессов,
спектр наблюдался при введении ротенона и FCCP. Из этих измерений
следовало, что ротенон и в меньшей степени FCCP частично снижали
мембранный потенциал и снижали активность всех ферментов митохондрии,
включая ферменты дыхательной цепи и АТФазу. Большая протяженность
доминирующих компонент при АТФ-стимуляции явилась основанием для
вывода о том, что активность АТФазных комплексов в митохондриях
имеет кооперативный характер и может быть измерена оптическими
методами в реальном времени. Из оценки площади корреляции следовало,
что число вовлеченных в кооперативный процесс АТФазных комплексов
может достигать 104 - 105. Мы предполагаем,
что такие кооперативные процессы могут быть источником когерентных
полей (механических деформаций, электрических зарядов), которые
могут распространятся на значительные в масштабах клетки расстояния
и являться физическим носителем биологических сигналов. Мы полагаем,
что дальнейшее изучение флуктуаций в органеллах и структурах клетки
позволит отождествлять различные внутриклеточные процессы с сигналами,
измеряемыми неинвазивными оптическими методами. Измерения спектров
и интенсивности флуктуаций при действии ротенона, разобщителя
и АТФ позволили отождествить протяженные компоненты с кооперативной
активностью АТФазных комплексов, а дельта-коррелированные - с
активностью ферментов дыхательной цепи. Мы предполагаем, что связанные
с кооперативными процессами сигналы имеют непосредственное отношение
к проблеме самоорганизации и клеточным биоритмам.