КООПЕРАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ В ИЗОЛИРОВАННОЙ МИТОХОНДРИИ

Тычинский В., Ягужинский Л., Вайсс Д.
Московский институт радиотехники, электроники и автоматики, 117454 Москва; НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, 119899 Москва; Центр микроскопии Университета г. Росток, Д-1805 Германия
Кооперативные процессы, являющиеся физическим базисом, определяющим пространственно-временную организацию жизни на клеточном уровне, в ряде случаев удавалось наблюдать на макромолекулярном уровне. В работе методом Динамической Фазовой Микроскопии были исследованы флуктуации оптических параметров, сопровождающих ферментативную активность в изолированных нативных митохондриях печени крысы in vitro. В спектрах флуктуаций были обнаружены компоненты с доминирующими частотами порядка единиц Герц и пространственной протяженностью, близкой к поперечному размеру митохондрий, а также дельта-коррелированные во времени компоненты с малыми (около 200 нм) радиусами корреляции. Измерения фазовой высоты профиля митохондрии h(x), где х - координата вдоль линии сканирования, производились вдоль произвольно выбранной линии в плоскости фазового изображения. При поперечном размере около 700 нм максимальная фазовая высота профиля не превышала hm=50 нм, что в предположении о сферической форме митохондрии дает максимальное значение разности эффективных показателей преломления внутренней и внешней сред Dn = 0,07. Вследствие происходящих в митохондрии процессов фазовая высота изменялась во времени и дисперсия этих временных флуктуаций высоты являлась количественной характеристикой интенсивности флуктуаций I(x). Распределение интенсивности флуктуаций I(x) по диаметру было неравномерно и по ее максимальному значению Im"15 нм2 можно было оценить средне-квадратичную амплитуду флуктуаций Im1/2"4 нм. Спектральный анализ флуктуаций показал наличие доминирующих компонент с частотами в интервале 1-20 Гц. Некоторые из них имели протяженность вдоль скан-линии до 600 нм, близкую к поперечному размеру митохондрии. Наблюдались также интенсивные локальные компоненты с шириной 50 - 100 нм, близкой к пределу пространственного разрешения микроскопа. Частота и интенсивность доминирующих компонент изменялись во времени и это свидетельствовало о нестационарности процессов с характерным временем порядка секунд. Всего были произведены измерения около 200 митохондрий. Нормальные и АТФ-стимулированные митохондрии имели больший уровень интенсивности (5 - 20 нм2). Для проверки гипотезы о связи флуктуаций с активностью ферментов в буфер добавлялись АТФ, FCCP и ротенон). Специфическое действие вводимых в буфер добавок и ингибиторов проявлялось в изменении интенсивности и спектра флуктуаций. АТФ-стимуляция усиливала интенсивность и контраст доминирующих компонент. Ротенон резко снижал Dn до уровня "10-2 и превышение интенсивности над уровнем шумов было в пределах точности измерений (0,2-0,5 нм2). Введение разобщителя FCCP приводило к снижению Dn до значений 0,02 - 0,03, падению интенсивности до 3-4 нм2 и к исчезновению контрастных компонент в спектрах. Добавление АТФ к FCCP почти не влияло на Dn и на общую интенсивность, но восстанавливало контрастные компоненты. Однородный, характерный для d-коррелированных процессов, спектр наблюдался при введении ротенона и FCCP. Из этих измерений следовало, что ротенон и в меньшей степени FCCP частично снижали мембранный потенциал и снижали активность всех ферментов митохондрии, включая ферменты дыхательной цепи и АТФазу. Большая протяженность доминирующих компонент при АТФ-стимуляции явилась основанием для вывода о том, что активность АТФазных комплексов в митохондриях имеет кооперативный характер и может быть измерена оптическими методами в реальном времени. Из оценки площади корреляции следовало, что число вовлеченных в кооперативный процесс АТФазных комплексов может достигать 104 - 105. Мы предполагаем, что такие кооперативные процессы могут быть источником когерентных полей (механических деформаций, электрических зарядов), которые могут распространятся на значительные в масштабах клетки расстояния и являться физическим носителем биологических сигналов. Мы полагаем, что дальнейшее изучение флуктуаций в органеллах и структурах клетки позволит отождествлять различные внутриклеточные процессы с сигналами, измеряемыми неинвазивными оптическими методами. Измерения спектров и интенсивности флуктуаций при действии ротенона, разобщителя и АТФ позволили отождествить протяженные компоненты с кооперативной активностью АТФазных комплексов, а дельта-коррелированные - с активностью ферментов дыхательной цепи. Мы предполагаем, что связанные с кооперативными процессами сигналы имеют непосредственное отношение к проблеме самоорганизации и клеточным биоритмам.