ВЫЯВЛЕНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ ЭКЗОГЕННЫХ ФЛУОРОФОРОВ В КЛЕТКАХ И СРЕЗАХ ТКАНЕЙ С ПОМОЩЬЮ ВИДЕОИНТЕНСИФИКАЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ С ПОСЛЕДУЮЩИМ АНАЛИЗОМ ИЗОБРАЖЕНИЙ

Гулак П. В., Рубина К. А., Киреев И. И., Кононенко Н. В., Баева О. В., Соболев А. С.
*Биофизическая лаборатория ВНИИСБ РАСХН; **МГУ им. М. В Ломоносова, 119899 Москва
Выявлению локализации экзогенного флуорофора в клетках и срезах тканей мешают в большей или меньшей степени, в числе прочих, два флуоресцентных свойства самих препаратов: 1) флуоресценция посторонних флуорофоров (аутофлуоресценция, флуоресценция другого флуорофора при двойном окрашивании); 2) флуоресценция частей препарата, расположенных вне исследуемого "оптического среза". Для устранения вклада других флуорофоров во флуоресцентное изображение препарата использован контрольный препарат (такие же клетки, соседний срез из той же серии), не содержащий исследуемого флуорофора и набор светофильтров к флуоресцентному микроскопу для получения флуоресцентного изображения препарата в дополнительной области спектра (ДОС) вблизи основной области спектра (ООС), выбранной в соответствии с флуоресцентными свойствами выявляемого флуорофора. Нами установлено, что существует хорошая пространственная корреляция интенсивности флуоресценции контрольного препарата в ДОС и ООС (коэффициент корреляции уровней серого находится в пределах от 0,55 до 0,85 для наборов пикселов свыше 100 вдоль отрезков прямых с одними и теми же координатами, пересекающих изображения клеток в указанных областях спектра). Это наблюдение позволяет принять допущение о пропорциональности интенсивностей флуоресценции препаратов в этих областях спектра, а коэффициент пропорциональности вычислять делением изображенния клеток контрольного образца в OOC на их изображение в ДОС. При относительно малом отношении сигнал/шум для надежного выявления флуорофора за коэффициент пропорциональности принято наибольшее значение из результатов деления, но при этом получается сверхкоррекция; в остальных случаях за коэффициент пропорциональности принято среднее значение отношения. Устранение вклада посторонней флуоресценции достигается вычитанием из изображения препарата с исследуемым флуорофором в ООС его изоображения в ДОС, умноженного на соответствующий коэффициент пропорциональности. Для устранения вклада флуоресценции частей препарата, расположенных вне "оптического среза" (над и под ним) применен метод D.А. Agard и соавт. (1989) "прояснения" флуоресцентного изображения с помощью манипуляций над ним и соседними (по оптической оси) изображениями в сочетании с методами обработки флуоресцентных изображений, изложенными в [Jerioevic Z. et а1. (1989)].