ПОЛУЧЕНИЕ АПТАМЕРОВ РНК К АМИЛАЗЕ BLMA

Головин А. В., Спиридонова В. А., Рассохин Т. И., Копылов А. М., Парк К. Х.
Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова,119899 Москва, Россия; *Сеульский национальный университет, Сувон, Южная Корея
В последние годы активно разрабатывается метод SELEX для отбора высокоаффинных олигонуклеотидов, специфически связывающихся с любыми наперед заданными молекулами (аптамеров). Аптамеры получены как к белкам, так и к низкомолекулярным соединениям и могут использоваться так же, как антитела. SELEX уже начинает конкурировать с прикладной иммунобиотехнологией. В данной работе получена популяция аптамеров РНК к амилазе - ферменту, который является не только лидером в крупномасштабной биотехнологии, но и важным для диагностики при лечении многих заболеваний. В качестве матрицы для исходной библиотеки синтезирован набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов с рэндомизированной областью в 30 нуклеотидов. Транскрипцией, с помощью РНК-полимеразы фага Т7, получена исходная библиотека РНК со степенью вырожденности около 1014. Селекция аптамеров проведена аффинной хроматографией на колонке с иммобилизованной мальтоамилазой из Bacillus licheniformis (BLMA). Начальное связывание составляло меньше 0,1%. После 6 циклов селекции библиотеки РНК в заданных начальных условиях проведена промежуточная оптимизация условий связывания фракции аптамеров с BLMA на нитроцеллюлозных фильтрах. Дальнейшая селекция была проведена в оптимизированных условиях, что позволило получить на 10 цикле селекции обогащенную фракцию аптамеров, которая характеризуется усредненной константой диссоциации Kd=3·10-7 M и уровнем связывания около 25% на колонке. Полученную фракцию аптамеров можно условно расматривать как популяцию поликлональных антител. В настоящее время проводится выбор условий для получения аптамеров с более высокими константами связывания и клонирование обогащенной популяции аптамерных РНК для получения индивидуальных аптамеров. Таким образом, в работе показана принципиальная возможность получения аптамеров РНК к амилазе - ферменту, который по своей природе не является РНК-связывающим белком. Работа выполнена по гранту KoSEF 97К2-1508-00-02-1.