ПОЛУЧЕНИЕ АПТАМЕРОВ РНК К АМИЛАЗЕ BLMA
Головин А. В., Спиридонова В. А., Рассохин Т. И., Копылов А. М., Парк К. Х.
Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова,119899 Москва, Россия; *Сеульский национальный университет, Сувон, Южная Корея
В последние годы активно
разрабатывается метод SELEX для отбора высокоаффинных олигонуклеотидов,
специфически связывающихся с любыми наперед заданными молекулами
(аптамеров). Аптамеры получены как к белкам, так и к низкомолекулярным
соединениям и могут использоваться так же, как антитела. SELEX
уже начинает конкурировать с прикладной иммунобиотехнологией.
В данной работе получена популяция аптамеров РНК к амилазе - ферменту,
который является не только лидером в крупномасштабной биотехнологии,
но и важным для диагностики при лечении многих заболеваний. В
качестве матрицы для исходной библиотеки синтезирован набор синтетических
олигодезоксирибонуклеотидов с рэндомизированной областью в 30
нуклеотидов. Транскрипцией, с помощью РНК-полимеразы фага Т7,
получена исходная библиотека РНК со степенью вырожденности около
1014. Селекция аптамеров проведена аффинной хроматографией
на колонке с иммобилизованной мальтоамилазой из Bacillus licheniformis
(BLMA). Начальное связывание составляло меньше 0,1%. После 6 циклов
селекции библиотеки РНК в заданных начальных условиях проведена
промежуточная оптимизация условий связывания фракции аптамеров
с BLMA на нитроцеллюлозных фильтрах. Дальнейшая селекция была
проведена в оптимизированных условиях, что позволило получить
на 10 цикле селекции обогащенную фракцию аптамеров, которая характеризуется
усредненной константой диссоциации Kd=3·10-7
M и уровнем связывания около 25% на колонке. Полученную
фракцию аптамеров можно условно расматривать как популяцию поликлональных
антител. В настоящее время проводится выбор условий для получения
аптамеров с более высокими константами связывания и клонирование
обогащенной популяции аптамерных РНК для получения индивидуальных
аптамеров. Таким образом, в работе показана принципиальная возможность
получения аптамеров РНК к амилазе - ферменту, который по своей
природе не является РНК-связывающим белком. Работа выполнена по
гранту KoSEF 97К2-1508-00-02-1.