КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЛЕГКОПЛАВКИХ УЧАСТКОВ ДНК ФАГА Т2 В ПРОЦЕССЕ ОБРАЗОВАНИЯ ОТКРЫТЫХ ПРОМОТОРНЫХ КОМПЛЕКСОВ С РНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ E. COLI

Камзолова С. Г., Иванова Н. Н., Камзалов С. С.
Институт биофизики клетки РАН, 142292 Пущино
Отличительной особенностью вторичной структуры ДНК Т-четных фагов, связанной с необычностью их нуклеотидного состава (65% АТ-пар, цитозин заменен на необычное основание 5-оксиметилцитозин, 75% которого находится в моно- или диглюкозилированной форме), является наличие легкоплавких участков. В частности, ДНК фага Т2 содержит легкоплавкие участки, расположенные на расстоянии 1500-2000 нуклеотидных пар друг от друга, причем, как показывает анализ нуклеотидных последовательностей фага Т2, эти участки, по-видимому, соответствуют upstream (-43- -55-) области ранних промоторов фага Т2. Возможность появления неспаренных оснований в легкоплавких участках Т2-ДНК делает возможной модификацию ее спиновой меткой 2,2',6,6'-тетраметил-4-бромоацетоксипиперидин-1-оксилом, реагирующей со свободными NH2-группами аденинов. Т2-ДНК, модифицированная этой спиновой меткой, использовалась для изучения роли легкоплавких участков в инициации транскрипции ранних генов фага Т2 РНК-полимеразой E. Coli. Были выбраны условия реакции, при которых спиновая метка реагировала преимущественно с легкоплавкими участками, о чем свидетельствовала низкая степень модификации Т2-ДНК (1 метка на 2000 пар оснований). Данная модификация не нарушала вторичной структуры ДНК, на что указывают температура и профиль плавления спин-меченой Т2-ДНК. Исследование суммарного синтеза РНК с использованием спин-меченой Т2-ДНК в качестве матрицы показало, что ее матричная активность снижалась более чем на 30%. При образовании открытых промоторных комплексов спин-меченой Т2-ДНК с РНК-полимеразой E. Coli, фермент защищал от гидролиза ДНКазой 1 участки ДНК, содержащие более 80% спиновой метки, связанной с ДНК. Этот результат свидетельствует об участии легкоплавких сайтов, не входящих в состав основных промоторных детерминант, в образовании открытых промоторных комплексов с РНК-полимеразой E. Coli. Показано, что при образовании промоторных комплексов с РНК-полимеразой легкоплавкие участки ДНК фага Т2 претерпевают конформационные изменения, отражающиеся в замедлении вращательной диффузии спиновых меток, причем эти изменения становятся более выраженными при переходе закрытых промоторных комплексов в открытые. Поскольку даже при образовании открытых промоторных комплексов не наблюдается изменения полярности окружения спиновых меток, обнаруженное увеличение времени вращательной корреляции связанных с ДНК спиновых меток нельзя объяснить прямым контактом спиновых меток с ферментом. Наблюдаемые конформационные изменения легкоплавких участков Т2-ДНК, по-видимому, могут быть связаны с образованием изгиба в -40- -60 области промоторов, индуцированного присоединением фермента, или же вызваны прямым взаимодействием между a-субъединицей РНК-полимеразы и легкоплавкими участками ДНК фага Т2 в upstream-области ранних промоторов. Полученные результаты указывают на роль легкоплавких участков как специфической промоторной детерминанты, характерной для ранних промоторов ДНК Т-четных фагов.