ИССЛЕДОВАНИЕ РАННИХ СТАДИЙ СЛИЯНИЯ ОБОЛОЧЕЧНОГО ВИРУСА С БЛМ

Максаев Г. И., Самсонов А. В., Фролов В. А.
Институт электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, 117071 Москва
О существовании мембранного вирусного белка М2 известно уже давно, но до сих пор остаются невыясненными как его назначение, так и функциональные особенности. Имеется только одна работа по регистрации активности выделенного из нативной мембраны и встроенного в синтетическую мембрану белка М2. Однако данные подобных экспериментов мало что говорят о природных свойствах белка. В нашей лаборатории в ходе экспериментов по слиянию мембран удалось встроить вирусную мембрану в синтетическую, по составу близкую к природным, и активировать М2-каналы. Белок при этом оставался в практически нативном липидном окружении и, как предполагается, не менял функциональных свойств. Отдельные частицы вируса гриппа штамма А/Japan/57 (тип Н2) были мечены липидным флуоресцентным красителем R18 в концентрации самотушения и затем адсорбированы на верхнюю поверхность горизонтальной БЛМ, содержащей 1 моль.% гликофорина MN и 5 моль.% дисиалоганглиозида Gd1a. Через 10 минут после подачи вируса интегральная интенсивность флуоресценции значительно увеличилась. Затем сверху к мембране была подведена пипетка с электродом, при этом второй электрод находился с другой стороны БЛМ. рН находящегося в пипетке раствора составлял 5,0. Вскоре после формирования плотного контакта между пипеткой и БЛМ (R> 10 ГОм) вирусные частицы, находившиеся на небольшим участке мембраны под пипеткой начали сливаться с БЛМ. Факт слияния регистрировался по увеличению интенсивности флуоресценции под пипеткой вследствие разбавления R18. При этом не наблюдалось изменения интенсивности флуоресценции для рН раствора в пипетке 7,4. За усилением флуоресценции следовало ступенчатое увеличение проводимости участка мембраны. Амплитуда ступеней составляла 100-300 пС при длительности 10-50000 мс. Анализ полученных данных показал, что скачки проводимости соответствуют открытиям и закрытиям одиночных каналов со средней проводимостью около 200пС. Эта электрическая активность блокировалась при добавлении во внешний раствор ремантадина в концентрации 10-4 мг/мл. Таким образом, мы заключаем, что была зарегистрирована активность одиночных М2-каналов. В каждом эксперименте были зарегистрированы 1-5 всплесков активности общей продолжительностью 5 - 30 с, причём каждый всплеск, вероятно, соответствовал слиянию отдельного вируса. Мы предполагаем, что для функционирования М2-канала требуется специфическое липидное окружение, которое исчезает при диффузии вирусных белков в БЛМ. Работа поддержана грантами РФФИ № 96-04-50779 и № 96-15-97972.