ИССЛЕДОВАНИЕ РАННИХ СТАДИЙ СЛИЯНИЯ ОБОЛОЧЕЧНОГО ВИРУСА С БЛМ
Максаев Г. И., Самсонов А. В., Фролов В. А.
Институт электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, 117071 Москва
О существовании мембранного
вирусного белка М2 известно уже давно, но до сих пор остаются
невыясненными как его назначение, так и функциональные особенности.
Имеется только одна работа по регистрации активности выделенного
из нативной мембраны и встроенного в синтетическую мембрану белка
М2. Однако данные подобных экспериментов мало что говорят о природных
свойствах белка. В нашей лаборатории в ходе экспериментов по слиянию
мембран удалось встроить вирусную мембрану в синтетическую, по
составу близкую к природным, и активировать М2-каналы. Белок при
этом оставался в практически нативном липидном окружении и, как
предполагается, не менял функциональных свойств. Отдельные частицы
вируса гриппа штамма А/Japan/57 (тип Н2) были мечены липидным
флуоресцентным красителем R18 в концентрации самотушения и затем
адсорбированы на верхнюю поверхность горизонтальной БЛМ, содержащей
1 моль.% гликофорина MN и 5 моль.% дисиалоганглиозида Gd1a. Через
10 минут после подачи вируса интегральная интенсивность флуоресценции
значительно увеличилась. Затем сверху к мембране была подведена
пипетка с электродом, при этом второй электрод находился с другой
стороны БЛМ. рН находящегося в пипетке раствора составлял 5,0.
Вскоре после формирования плотного контакта между пипеткой и БЛМ
(R> 10 ГОм) вирусные частицы, находившиеся на небольшим участке
мембраны под пипеткой начали сливаться с БЛМ. Факт слияния регистрировался
по увеличению интенсивности флуоресценции под пипеткой вследствие
разбавления R18. При этом не наблюдалось изменения интенсивности
флуоресценции для рН раствора в пипетке 7,4. За усилением флуоресценции
следовало ступенчатое увеличение проводимости участка мембраны.
Амплитуда ступеней составляла 100-300 пС при длительности 10-50000
мс. Анализ полученных данных показал, что скачки проводимости
соответствуют открытиям и закрытиям одиночных каналов со средней
проводимостью около 200пС. Эта электрическая активность блокировалась
при добавлении во внешний раствор ремантадина в концентрации 10-4
мг/мл. Таким образом, мы заключаем, что была зарегистрирована
активность одиночных М2-каналов. В каждом эксперименте были зарегистрированы
1-5 всплесков активности общей продолжительностью 5 - 30
с, причём каждый всплеск, вероятно, соответствовал слиянию отдельного
вируса. Мы предполагаем, что для функционирования М2-канала требуется
специфическое липидное окружение, которое исчезает при диффузии
вирусных белков в БЛМ. Работа поддержана грантами РФФИ № 96-04-50779
и № 96-15-97972.