ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АДЕНОВИРУСОВ КАК ЭНДОСОМОЛИТИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДОВАННЫХ ДНК-ПЕРЕНОСЯЩИХ КОНСТРУКЦИЙ: ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ И ОПТИМИЗАЦИЯ СИСТЕМЫ (АДЕНОВИРУС - СТРЕПТАВИДИН-ПОЛИЛИЗИН) - ДНК - ИНСУЛИН-ПОЛИЛИЗИН

Смирнова О. А., Розенкранц А. А., Соболев А. С.
ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, 127550 Москва; *Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119899 Москва
Исследование механизмов рецептор-опосредованной трансфекции показало, что компартментализация ДНК-переносящих конструкций в везикулярных эндоцитозных структурах является одним из главных лимитирующих этапов внутриклеточного транспорта конструкций. Использование компонентов, дестабилизирующих везикулярные мембраны и способствующих тем самым выходу конструкций в цитоплазму, позволяет значительно интенсифицировать рецептор-опосредованную доставку ДНК. Одними из самых эффективных эндосомолитических агентов являются аденовирусы. Аденовирусы птиц (EDS-76 и CELO) и человека (Ad5 штамм dl312) были применены для усиления инсулин-рецептор-опосредованной трансфекции клеток млекопитающих. Эндосомолитические свойства аденовирусов тестировали по способности обеспечивать выход кальцеина из липосом. Исследование рН-зависимости действия аденовирусов на липосомы показало, что максимальное течение липосом для всех вирусов наблюдалось при рН 3. CELO и EDS аденовирусы оказывали полумаксимальное действие при рН 4 и влияли на течение липосом вплоть до рН 6. Преинкубация аденовирусов при рН 3 приводила к уменьшению их литической активности. Вирус-содержащие ДНК-переносящие конструкции собирали путем последовательного добавления к биотинилированному аденовирусу стрептавидин-полилизина, ДНК и инсулин-полилизина. Было исследовано влияние аденовируса в комплексе с полилизином или в составе полной конструкции на течение липосом. Получены зависимости течения липосом от молярного соотношения стрептавидин-полилизин/аденовирус и от соотношения лизин/нуклеотид в конструкции. Вируссодержащие конструкции были использованы для трансфекции клеток эпителия молочной железы мыши линии НС-11. Выявлена частичная корреляция литических свойств аденовирусов в составе конструкций и эффективности экспрессии репортерного гена в результате трансфекции данными конструкциями. Проведена работа по оптимизации состава конструкций с целью получения максимального уровня экспрессии репортерного гена. Наиболее эффективными оказались конструкции с соотношениями лизин/нуклеотид = 2 и плазмида/аденовирус порядка 10.