КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ДНК ФАГА Т2 ПРИ ОБРАЗОВАНИИ ОТКРЫТЫХ ПРОМОТОРНЫХ КОМПЛЕКСОВ С РНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ E.coli. ЭФФЕКТ ДАЛЬНОДЕЙСТВИЯ В ДНК
Иванова Н. Н., Камзалов С. С., Камзолова С. Г.
Институт биофизики клетки РАН, 142292 Пущино
ДНК фага Т2 дикого типа
характеризуется необычным нуклеотидным составом: вместо обычного
цитозина в нее входит 5-оксиметилцитозин, находящийся в глюкозилированной
форме. Присутствие необычного основания со свободными ОН-группами
делает возможной модификацию ДНК фага Т2 спиновой меткой, реагирующей
с ОН-группами - N-(2,2',5,5'-тетраметил-3-карбоксипирролидин-1-оксил)-имидазолом.
Были подобраны условия реакции, при которых достигается достаточно
высокая степень модификации (1 метка на 50-100 пар оснований).
Несмотря на высокую степень модификации, спин-мечение не нарушает
вторичной структуры Т2-ДНК, о чем свидетельствует температура
и профиль плавления модифицированной ДНК. Модификация также практически
не влияет на матричные свойства Т2-ДНК в процессе транскрипции,
о чем можно судить по суммарному синтезу РНК на спин-меченой матрице,
а также по соотношению инициации транскрипции с А- и G-стартующих
промоторов. Присоединение метки к Т2-ДНК приводит к увеличению
времени ее вращательной корреляции. Значения тензора g
и тензора сверхтонкого расщепления A при этом не меняются, что
указывает на отсутствие изменений полярности окружения спиновой
метки при присоединении ее к ДНК. Образование открытых промоторных
комплексов спин-меченой Т2-ДНК с РНК-полимеразой E. coli
сопровождается уменьшением времени вращательной корреляции связанной
с ДНК метки, значения тензоров g и A при этом остаются неизменными.
Поскольку наиболее простым объяснением в данном случае может быть
отсоединение метки от ДНК в процессе образования открытых промоторных
комплексов, для проверки этой возможности были проведены эксперименты
по протеолизу РНК-полимеразы в комплексах трипсином. После протеолитической
деградации фермента в комплексе с Т2-ДНК время вращательной корреляции
спиновой метки возвращается к значениям, характерным для исходной
спин-меченой Т2-ДНК. Таким образом, образование открытых промоторных
комплексов сопровождается конформационными изменениям матрицы,
которые выражаются в увеличении вращательной подвижности связанной
с Т2-ДНК спиновой метки. Эти конформационные изменения являются
специфическими для открытых промоторных комплексов, поскольку,
как было показано, они не наблюдаются в отсутствие s-фактора
или при температуре 10°С.
Учитывая степень модификации Т2-ДНК (1 метка на 50-100 пар оснований),
расстояние между ранними промоторами фага Т2 (1500-2000 пар оснований),
а также размеры участка, закрываемого ферментом в открытом комплексе
(не более 100 пар оснований), можно предположить, что наблюдаемые
конформационные изменения распространяются на достаточно большие
расстояния (несколько сот пар оснований). Проведен анализ применимости
известных теоретических моделей динамики ДНК для объяснения этого
эффекта.