Ион-транспортирующие АТФазы Р-типа (или Е1-Е2-типа), в частности, Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума и Na-,K-АТФаза плазматических мембран, в процессе работы могут находиться в двух основных конформациях - Е1 и Е2, переход между которыми обеспечивается связыванием переносимых ионов и фосфорилированием/дефосфорилированием фермента в процессе гидролиза АТФ. Исследование конформационных переходов ион-транспортирующих АТФаз с использованием классических методов анализа вторичной структуры белков (круговой дихроизм, Рамановская и Фурье-ИК-спектроскопия) затруднено, так как содержание a-спиральных и b-структурных доменов в молекулах этих ферментов при Е1-Е2-переходе изменяется незначительно (на 1-2%). Для детального анализа конформационной подвижности в Са-АТФазу в условиях, позволяющих модифицировать единственную SH-группу в молекуле фермента, была включена флуоресцентная метка 7-хлор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазол, а Na,K-АТФаза была модифицирована йодацетамидфлуоресцеином. Интенсивность флуоресценции меченых препаратов обеих АТФаз при переходе из Е2 в Е1 конформацию увеличивается на 70-80%. Аналогичное увеличение интенсивности флуоресценции наблюдается с ростом рН среды в диапазоне 6,0 - 9,0, а также при связывании аллостерического субстрата АТФ (но не ГТФ). Генерацию вторых гармоник исследовали после прикрепления мембранных препаратов Са-АТФазы и Na,K-АТФазы к стеклянной поверхности, обработанной гексаметилдисилазаном. Вторые гармоники (l=532 нм) генерируются при освещении образцов светом аргонового лазера (l = 1064 нм), причем их интенсивность зависит от того, в какой конформации (Е1 или Е2) находится фермент. Интенсивность вторых гармоник увеличивается на 80-100% при связывании с обеими АТФазами АТФ (но не ГТФ) и при образовании двумерных кристаллов Са-АТФазы в мембранах СР в присутствии ванадата. Для анализа
вращательной подвижности молекул ферментов в мембранах остаток лизина, находящийся в АТФ-связывающем центре, специфически метили 5-эозинизотиоцианатом, и анализировали кривые затухания анизотропии фосфоресценции. Полученные экспериментальные кривые наиболее адекватно описываются суммой двух экспонент, что позволяет говорить о присутствии в мембране вращающихся частиц разного размера. Быстрая компонента (время вращательной корреляции 12-15 mс) отражает, по-видимому, вращение в мембране мономерной формы фермента, тогда как медленная компонента (время вращательной корреляции 200-400 mс) связана с присутствием в мембране олигомерных комплексов Са-АТФазы и Na,K-АТФазы. Вклад быстрой и медленной компонент в общую анизотропию изменяется при Е1-Е2 переходе, однако и мономерная, и олигомерная формы фермента присутствуют в мембранах независимо от конформационного состояния обеих АТФаз. (Поддержано грантом РФФИ № 98-04-49184 и грантом FEBS.).