ЗАВИСИМОСТЬ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАНСФЕКЦИИ КЛЕТОК В КУЛЬТУРЕ ОТ ЗАРЯДА МОДУЛЬНЫХ КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ ПЕРЕНОСА ГЕНОВ ПРИ ПОМОЩИ РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДОВАННОГО ЭНДОЦИТОЗА
Розенкранц А. А., Смирнова О. А., Иванов Н. Е., Соболев А. С.
Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119899 Москва; * Биофизическая лаборатория, ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, 127550 Москва
Ранее нами была
noкaзaнa (Sobolev
et al., 1998) возможность использования эндоцитируемой ДНК-переносящей
конструкции с инсулином в качестве эндоцитируемого лиганда для
переноса генов in vitro
и in vivo.
В продолжение этой работы мы представляем результаты исследования
влияния состава модульной ДНК-переносящей конструкции на эффективность
трансфекции. На двух линиях клеток (гепатома человека
PLC/PRF/5 и эпителий
молочной железы мыши НС-11) по измерению активности переносимого
гена светлячковой люциферазы показана эффективная трансфекция
при помощи рецептор-опосредованного переноса генов. Для трансфекции
была использована конструкция, состоящая из биотинилированного
инсулина в качестве эндоцитируемого лиганда, конъюгата стрептавидин-полилизин,
биотинилированного аденовируса для транспорта ДНК из эндосом и
плазмиды. При помощи видеоинтенсификационной микроскопии, а также
по ингибированию процесса избытком свободного инсулина либо моноклональными
антителами против инсулина показано, что ДНК-переносящая конструкция
проникает в клетки при помощи рецептор-опосредованного эндоцитоза,
и перераспределяется в них за счет эндосомолитического компонента -
аденовируса. Проведено исследование влияния заряда ДНК-переносящей
конструкции, который меняли при помощи изменения соотношения аминогрупп
полилизина и фосфатов ДНК, на эффективность переноса генетического
материала в клетки. Показано, что оптимальная трансфекция достигается
при соотношении лизин : нуклеотид = 2 для трансфекции клеток НС-11
и соотношении лизин : нуклеотид = 9 для трансфекции клеток PLC/PRF/5.
Продемонстрировано, что эффективность трансфекции клеток разного
типа несущих один и тот же эндоцитируемый рецептор определяется
не только наличием лиганда в составе ДНК-переносящей конструкции,
но также и ее общим зарядом.