ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ Сa(2+)-КАНАЛОВ, УПРАВЛЯЕМЫХ МЕМБРАННЫМ ПОТЕНЦИАЛОМ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫМИ Сa(2+)-ДЕПО НА РС-12 ФЕОХРОМОЦИТОМНЫХ КЛЕТКАХ

Асташкин Е. И., Широкова Е. А., Смирнов О. Н., Гривенников И. А., Твердислов В. А., Грачев С. В.
Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова Физический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, Москва; *Институт молекулярной генетики РАН
В плазматических мембранах клеток РС-12 описаны все виды Са2+-каналов, известных в настоящее время. Они представлены: VOC (потенциал управляемыми) каналами, ROC (рецептор регулируемыми) каналами, SMOC-каналами (регулируемыми вторичными мессенджерами) и CRAC-каналами (регулируемыми внутриклеточным Са2+-депо). Установлено, что активность L типа VOC-каналов эффективно подавляется "антагонистами" ионов Са2+, в том числе верапомилом (Ver). Активность ROC-, SMOC-, CRAC-каналов блокируется некоторыми производными имидазола. Целью работы было изучить в сравнительном плане активность VOC- и CRAC- типов Са2+-каналов на РС-12 феохромоцитомных клетках, а также определить способность антагонистов ионов Са2+ влиять на потенциалнезависимые Са2+-каналы, на примере CRAC-каналов. О транспорте ионов Са2+ судили по изменению внутриклеточной концентрации свободных ионов Са2+ измеренной с помощью флуоресцентного Са2+-зонда - Фуры 2. VOC-каналы переводили в открытое состояние путем деполяризации плазматической мембраны клеток с помощью добавок влиятельной концентрации KCl (50 мМ). В ответ на деполяризацию наблюдалось резкое возрастание [Са2+]i от базального уровня (100+8 нМ) до 300-350 нМ с последующим выходом на стационарный уровень 220-250 нМ. Активацию CRAC-каналов производили с помощью специального блокатора Са2+АТРазы внутриклеточного Са2+-депо - тапсигаргина (TG) (10-10 М). Са2+ ответ на TG имеет характерный вид: за быстрым первоначальным увеличением [Са2+]i (от 95-100 нМ до 250-270 нМ) следовало снижение этого показателя до 170-180 нМ, с последующим увеличением до 220-230 нМ. Концентрационная зависимость эффекта TG имела вид кривой с насыщением, которое наступало при концентрации TG 250 нМ и выше - до 2 мкМ. Обработка РС-12-клеток TG (400 нМ) на фоне действия KCl сопровождалось выраженным Са2+ ответом, форма которого была изменена, а амплитуда - снижена действием отдного TG. Этот результат свидетельствует об электрогенной природе транспорта ионов Са2+ по CRAC-каналам. Ver (20 мкМ) полностью подавлял активность VOC-каналов и практически не влиял на CRAC-каналы. Из этих ответов можно заключить, что Ver (до 20 мкМ) не влияет на потенциал независимые Са2+-каналы, а следовательно не может быть использован для подавления Са2+-каналов электроневозбудимых клеток. CRAC-каналы, активируется в результате истощения Са2+-депо с помощью TG, эффективно подавляемы арахидоновой кислотой (3-10 мкМ), в то же время Ver (20 мкМ) не блокировал Са2+-каналы на фоне действия TG. Деполяризация мембраны (KCl 50 мМ) в среде без ионов Са2+ не приводит к выходу ионов Са2+ из депо и не подавляет выход Са2+, индуцированный TG (400 нМ). Эти данные говорят о том, что внутриклеточные Са2+-депо, по-видимому, не контактируют с плазматической мембраной.