ПРИНЦИПЫ СКРИНИНГА ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ МАРКЕРОВ СТРУКТУРНОГО СОСТОЯНИЯ И СВЯЗЫВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ БЕЛКОВ
Гаврилов В. Б., Конев С. В.
Институт фотобиологии НАНБ, 220072 Минск, Беларусь
На примере взаимодействия
флуоресцентных зондов (ФЗ) 8-анилинонафталинсульфоната (АНС),
пирронового красного (ПК) и карбоксифенилимида диметиламинонафталиндикарбоновой
кислоты (К35) с сывороточным альбумином человека (САЧ) предложена
поэтапная схема скрининга флуоресцентных маркеров структурного
состояния и связывающей способности белков, основанная на определении
чувствительности флуоресцентной детекции ФЗ и их сродства к гидрофобным
центрам связывания белка. Эта схема включает: 1)
использование в
качестве эталонов зонда АНС и белка САЧ; 2)
определение спектрального
положения максимума возбуждения и испускания флуоресценции ФЗ
в комплексе с белком; 3) измерение
параметров связывания ФЗ с белком методом двойного флуориметрического
титрования; 4) оценку
белок-зависимой активации флуоресценции в режимах избытка белка
и зонда и расчет показателей флуоресцентной детекции ФЗ; 5)
классификацию ФЗ
как маркеров структурного состояния белков. Показателями чувствительности
и специфичности ФЗ при этом служат активация флуоресценции зонда
в условиях избытка белка и константа его связывания с сильным
высокоаффинным центром сорбции белка; 6)Классификацию ФЗ как маркеров
связывающей способности, характеризуемых по белок-зависимому усилению
флуоресценции в условиях избытка зонда и по константе его связывания
со слабыми вторичными центрами связывания белка. Зонд ПК по своим
связывающим характеристикам может рассматриваться как длинноволновый
"красный" аналог АНС.