РОТАЦИОННАЯ ВИСКОЗИМЕТРИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ ПРИРОДНЫХ КОМПЛЕКСОВ ДНК
Стручков В. А., Володин Ю. Ю.
Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН, 115478 Москва
Использовали ротационную
вискозиметрию Зимма для определения молекулярных параметров высокополимерных
природных комплексов ДНК (ПК ДНК), полученных при щелочном лизисе
клеток сперматозоидов вьюна (СП) и асцитной опухоли Эрлиха (АОЭ).
Особенностью ротационной вискозиметрии ПК ДНК является колоколообразная
форма кривой зависимости вязкости от числа оборотов ротора. Вязкостные
характеристики комплекса оценивали по трем точкам в области максимума
на колоколообразной кривой. С целью установления молекулярных
параметров интактного ПК ДНК и его субъединиц в случае предельной
фрагментации комплекса изучали зависимость вязкости от концентрации
ДНК, pH лизирующей смеси, температуры (24 и 50оC) и
времени лизиса (от 0 до 20 суток). На щелочных лизатах СП [0,9М
NaCl, 0,1М NaOH, 0,01М ЭДТА (ННЭ-0,1), 24оC, 1 ч] установлено,
что в зависимости от концентрации ПК ДНК он может находиться в
двух состояниях. При концентрации ДНК 2-4 мкг/мл лизата - комплекс
находится в виде стабильных гелеобразных эллипсоидов, которые,
по-нашему мнению, являются нуклеоидоподобными структурами генома.
При уменьшении концентрации ДНК в лизате комплекс релаксирует,
его приведенная вязкость сильно возрастает и при концентрациях
ДНК 0,4-1,5 нг/мл выходит на плато, т.е. ПК ДНК приобретает свойства
истинного раствора, что позволяет определить его характеристическую
вязкость - 2,4.105 дл/г и молекулярную массу
- 2.1012 Да (уравнение 1: [h]=1,435.10-4.М0,727).
Предельный распад комплекса СП на однонитевые фрагменты происходит
при длительной инкубации при 24оC (10-20 суток) в лизирующем
растворе ННЭ-0,1 и ускоряется (3-10 суток) в лизирующем растворе
ННЭ-0,45 (0,45М NaOH). Молекулярная масса этих однонитевых фрагментов
ДНК, рассчитанная из уравнения 1, равна 1.107
Да. Такие же фрагменты получены и после лизиса комплекса при 50оC
(ННЭ-0,1, 24 ч и ННЭ-45, 2 ч). Аналогичные эксперименты на щелочных
лизатах комплекса АОЭ (ННЭ-0,1, 24оC, 1 ч) показали,
что по молекулярной массе (уравнение 1) он также соизмерим с молекулярной
массой генома (М=1.1012 Да). В работе
обсуждаются физико-химические аспекты: 1) причины колоколообразной
зависимости вязкости лизатов ПК ДНК от числа оборотов ротора;
2) адекватность метода ротационной вискозиметрии при оценке молекулярных
параметров высокополимерных интактных комплексов ДНК; 3) структурная
организация ПК ДНК и его субъединиц.