ПРОСТОЙ И БЫСТРЫЙ МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ БОЛЬШИХ ОДНОСЛОЙНЫХ ЛИПОСОМ, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ

Шольц К. Ф., Лагутина Л. С., Мамаев Д. В.
Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, 117071 Москва
Для изучения функции мембранных белков необходима их реконструкция в мембранах липосом. При этом важно, чтобы липосомы имели низкую собственную проницаемость и большой удельный объем (W0). С этой целью в настоящее время обычно используют липосомы, получаемые путем удаления детергента из липидного солюбилизата с помощью твердых адсорбентов (А-липосомы). Ранее было установлено, что некоторые соединения (в том числе тритон X-100) обладают свойствами каналогенов, т.е. при сублитических концентрациях индуцируют образование в фосфолипидном бислое спорадических каналов переменных размеров. Поскольку это свойство каналогенов способствует дестабилизации мембран, оказалось, что его можно использовать для получения крупных липосом, минуя стадию солюбилизации липида. Вариант методики получения таких липосом (TC-липосомы) сводится к следующему: в суспензию азолектина (2 мг/мл), содержащую многослойные липосомы, вводят тритон X-100 (15 мг/мл) и через 20 мин добавляют раствор b-циклодекстрина (3,6 мг/мл) для связывания детергента. Стехиометрия комплекса тритон·циклодекстрин близка к 1:1. Реакция завершается за ~1 мин. Удельный объем TC-липосом составляет около 17 мкл/мг липида, что соответствует среднему диаметру везикул 0,35 мкм (для A-липосом W0 " 5 мкл/мг). W0 стабилен во времени: через 600 с он составляет 98,7% от W0 на 30 с после начала удаления внешнего маркера. Реконструкция мембранного белка (порин митохондрий) в этих липосомах проходит в соответствии с ранее разработанной теорией: зависимость удерживаемого объема протеолипосом (W) от концентрации белка (p) отвечает уравнению p = - pe ln(W/W0). Метод открывает возможность, в частности, для простого и быстрого определения молярного содержания мембранных белков.