АНАЛИЗ СПЕКТРОВ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ ПРОДАНА И АКРИЛОДАНА В БЕЛКАХ
Решетняк Я. К., Андреев О. А., Борейдо Дж., Емельяненко В. И., Бурштейн Э. А.
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН; *Department Molecular Biology & Immunology, University of North Texas, TX, USA
Исследована возможность
описания лог-нормальной функцией и компонентного анализа спектров
флуоресценции высоко чувствительных к полярности окружения зондов
6-пропионил-2-диметиламинонафталина (продан; Pr) и 6-акрилоил-2-диметиламинонафталина
(акрилодана; Ас) в белках, аналогично ранее разработанным приемам
анализа спектров триптофановой флуоресценции белков. Показано,
что продан и ковалентно связанный с цистеином трипептида (Lys-Cys-Phe)
акрилодана в растворителях различной полярности и их смесях флуоресцируют
в виде одной широкой асимметричной полосы. В пределах экспериментальной
точности спектры описываются лог-нормальной функцией, параметрами
которой являются максимальная интенсивность, положения максимума
и двух полумаксимальных амплитуд спектра. Анализ параметров лог-нормальной
функции показал, что положение полумаксимальных амплитуд линейно
зависит от положения максимума и, следовательно, форма спектра
флуоресценции хромофоров определяется только положением максимума.
Полученные зависимости позволили уменьшить до двух количество
параметров, определяющих форму спектра при решении задачи определения
положения и вкладов аналитических компонент в сложном спектре
флуоресценции хромофоров в белках, представляя его в виде суммы
вкладов эмпирических однопараметрических лог-нормальных функций.
Компонентный анализ спектров, полученных при титровании
3 mM Pr сывороточным альбумином быка (САБ) показал, что спектры
невалентных комплексов описываются двумя лог-нормальными однопараметрическими
компонентами: коротковолновой с постоянным положением максимума
при 453 нм и длинноволновой, положение которой смещается в коротковолновую
область от 526 до 518 нм при увеличении отношения концентраций
[САБ]/[Pr] от 0,2 до 4,5. Постоянное положение максимума коротковолновой
компоненты указывает на то, что излучение Pr происходит из центра
с наибольшим сродством, с так называемого локально возбужденного
состояния, характеризующегося низкополярным окружением и отсутствием
дипольной релаксации за время жизни возбужденного состояния. Наличие
длинноволновой компоненты, положение максимума которой отличается
от положения максимума излучения Pr в воде, соответствует излучению
из центров САБ с более низким сродством к Pr, в которых молекула
Pr частично доступна растворителю. Наблюдаемый коротковолновый
сдвиг положения максимума этой компоненты при увеличении концентрации
белка связан с перераспределением молекул Pr по более сильным
центрам связывания менее доступным воде и более ограниченной дипольной
релаксацией окружения. Спектр флуоресценции Ас, ковалентно
связанного с Суs707 субфрагмента S1 миозина, описывается двумя
лог-нормальными компонентами с положением максимумов 451 и 503
нм с отношением вкладов 1:9. В присутствии внешнего тушителя иодида
наблюдается тушение флуоресценции только длинноволновой компоненты
с константой Штерна-Фольмера равной 1М-1, что в 3 раза
меньше константы тушения Ас в воде. Следовательно, окружение Суs707
в субфрагменте S1, находится в лабильном состоянии и можно выделить
две равновесных конформации различающиеся по доступности хромофору
для молекул воды. Спектр флуоресценции Ас, связанного
с Суs393 G-актина имеет максимум 490 nm и полуширину 3600 см-1,
что превышает значение полуширины спектра АС при данном положении
максимума в чистых растворителях и описывается суммой двух лог-нормальных
компонент с положением максимумов 480 и 520 нм. Положение максимумов
компонент позволяет предположить, что окружение остатка Суs393
достаточно лабильно: по-видимому, в окрестности хромофора выделяются
две равновесные конформации с различной скоростью дипольной релаксации.
Эти результаты подтверждают возможность анализа спектров
излучения зондов и меток с помощью разложения на лог-нормальные
компоненты.