КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЛЕГКОПЛАВКИХ УЧАСТКОВ ДНК ФАГА Т2 В ПРОЦЕССЕ ОБРАЗОВАНИЯ ОТКРЫТЫХ ПРОМОТОРНЫХ КОМПЛЕКСОВ С РНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ E. COLI
Камзолова С. Г., Иванова Н. Н., Камзалов С. С.
Институт биофизики клетки РАН, 142292 Пущино
Отличительной особенностью
вторичной структуры ДНК Т-четных фагов, связанной с необычностью
их нуклеотидного состава (65% АТ-пар, цитозин заменен на необычное
основание 5-оксиметилцитозин, 75% которого находится в моно- или
диглюкозилированной форме), является наличие легкоплавких участков.
В частности, ДНК фага Т2 содержит легкоплавкие участки, расположенные
на расстоянии 1500-2000 нуклеотидных пар друг от друга, причем,
как показывает анализ нуклеотидных последовательностей фага Т2,
эти участки, по-видимому, соответствуют upstream (-43- -55-) области
ранних промоторов фага Т2. Возможность появления неспаренных оснований
в легкоплавких участках Т2-ДНК делает возможной модификацию ее
спиновой меткой 2,2',6,6'-тетраметил-4-бромоацетоксипиперидин-1-оксилом,
реагирующей со свободными NH2-группами аденинов. Т2-ДНК,
модифицированная этой спиновой меткой, использовалась для изучения
роли легкоплавких участков в инициации транскрипции ранних генов
фага Т2 РНК-полимеразой E. Coli. Были выбраны условия реакции,
при которых спиновая метка реагировала преимущественно с легкоплавкими
участками, о чем свидетельствовала низкая степень модификации
Т2-ДНК (1 метка на 2000 пар оснований). Данная модификация не
нарушала вторичной структуры ДНК, на что указывают температура
и профиль плавления спин-меченой Т2-ДНК. Исследование суммарного
синтеза РНК с использованием спин-меченой Т2-ДНК в качестве матрицы
показало, что ее матричная активность снижалась более чем на 30%.
При образовании открытых промоторных комплексов спин-меченой Т2-ДНК
с РНК-полимеразой E. Coli, фермент защищал от гидролиза
ДНКазой 1 участки ДНК, содержащие более 80% спиновой метки, связанной
с ДНК. Этот результат свидетельствует об участии легкоплавких
сайтов, не входящих в состав основных промоторных детерминант,
в образовании открытых промоторных комплексов с РНК-полимеразой
E. Coli. Показано, что при образовании промоторных комплексов
с РНК-полимеразой легкоплавкие участки ДНК фага Т2 претерпевают
конформационные изменения, отражающиеся в замедлении вращательной
диффузии спиновых меток, причем эти изменения становятся более
выраженными при переходе закрытых промоторных комплексов в открытые.
Поскольку даже при образовании открытых промоторных комплексов
не наблюдается изменения полярности окружения спиновых меток,
обнаруженное увеличение времени вращательной корреляции связанных
с ДНК спиновых меток нельзя объяснить прямым контактом спиновых
меток с ферментом. Наблюдаемые конформационные изменения легкоплавких
участков Т2-ДНК, по-видимому, могут быть связаны с образованием
изгиба в -40- -60 области промоторов, индуцированного присоединением
фермента, или же вызваны прямым взаимодействием между a-субъединицей
РНК-полимеразы и легкоплавкими участками ДНК фага Т2 в upstream-области
ранних промоторов. Полученные результаты указывают на роль легкоплавких
участков как специфической промоторной детерминанты, характерной
для ранних промоторов ДНК Т-четных фагов.