Для выяснения механизмов сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию особое внимание уделяется исследованию структурных и термодинамических свойств интермедиатов в равновесных условиях. Объект нашего исследования - лизоцим молока лошади (ЛЛ) - структурно гомологичен хорошо изученным белкам: другим лизоцимам с-типа (chiken type) и a-лактальбумину. ЛЛ интересен тем, что, в отличие от большинства других лизоцимов, он является кальций-связывающим белком, а разворачивание его происходит в два этапа. Проведено исследование спектральных и термодинамических свойств ЛЛ с использованием кругового дихроизма, собственной триптофановой флуоресценции, флуоресценции гидрофобного зонда АНС и дифференциальной сканирующей микрокалориметрии в присутствии и отсутствие Са²⁺ (апо- и холоформы) и в кислом состоянии (А-форма). Усиление интенсивности флуоресценции АНС в комплексе с апоформой белка при pH=4,5 в сравнении с холоформой показывает, что гидрофобные поверхности более доступны растворителю в апоформе. Спектры КД при pH=4,5 обнаруживают небольшое снижение асимметрии окружения ароматических остатков после удаления Ca²⁺. pH-зависимость триптофаниловой флуоресценции демонстрирует, что константа диссоциации карбоксильных групп белка больше в апоформе, чем в холоформе, и что в апобелке одна из карбоксильных групп изменяет свое состояние. Изменение интенсивности флуоресценции апобелка в интервале рН 5-8 с рК_a=6,2 и отсутствие перехода в этой области рН в холоформе показывает, что остатки гистидина и глутаминовой кислоты могут влиять на триптофановую флуоресценцию белка только в апосостоянии. Компонентный анализ спектров триптофановой флуоресценции в присутствии тушителей показал, что при рН 4,5 доступность константы Штерна-Фольмера для наружных (незащищенных) остатков триптофана как при тушении акриламидом, так и иодид-ионом не изменяются, но для погруженных остатков константа возрастает в 3 раза для апоформы в сравнении с холоформой для иода. В кислом состоянии (А-форме) при рН 2 константа Штерна-Фольмера тушения ионами иода внутренних остатков триптофана оказалась меньше, чем в апоформе при рН 4,5, что указывает на то, что при рН 2 часть остатков триптофана находится в более жестком и менее доступном воде гидрофобном окружении, чем в апоформе, хотя увеличение интенсивности флуоресценции гидрофобного зонда АНС и спектры КД указывают, что молекула ЛЛ обладает всеми свойствами "расплавленной глобулы". По данным дифференциальной сканирующей микрокалориметрии, ЛЛ в широком диапазоне экспериментальных условий с повышением температуры разворачивается в две последовательные кооперативные стадии. Энтальпия плавления и температура максимума первого пика сильно зависят от концентрации Са²⁺ (возрастают при ее увеличении). Так как Ca²⁺-связывающий центр находится в b-домене молекулы ЛЛ, первый пик ассоциируется с плавлением b-домена. Однако большая величина энтальпии первого перехода в сравнении с энтальпией второго перехода позволяет предположить, что низкотемпературный пик кривой теплопоглощения относится не только к разворачиванию b-домена, но и к разрушению контактной области между доменами. При увеличении концентрации кальция низкотемпературный пик сдвигается в область высоких температур с увеличением энтальпии.В присутствии 30 мМ Са²⁺ температуры максимумов двух переходов совпадают и ЛЛ разворачивается почти так же кооперативно, как лизоцим белка куриного яйца. Таким образом, в работе показано, что в состоянии расплавленной глобулы часть ароматических остатков триптофана, расположенных в различных участках полипептидной цепи, находится в гидрофобном ядре и менее доступна молекулам воды, чем в нативном состоянии. При высокой концентрации Са²⁺ образуется область, так стабилизирующая структуру молекулы, что ЛЛ плавится как единая кооперативная система.