ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АДЕНОВИРУСОВ КАК ЭНДОСОМОЛИТИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДОВАННЫХ ДНК-ПЕРЕНОСЯЩИХ КОНСТРУКЦИЙ: ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ И ОПТИМИЗАЦИЯ СИСТЕМЫ (АДЕНОВИРУС - СТРЕПТАВИДИН-ПОЛИЛИЗИН) - ДНК - ИНСУЛИН-ПОЛИЛИЗИН
Смирнова О. А., Розенкранц А. А., Соболев А. С.
ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, 127550 Москва; *Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119899 Москва
Исследование
механизмов рецептор-опосредованной трансфекции показало, что компартментализация
ДНК-переносящих конструкций в везикулярных эндоцитозных структурах
является одним из главных лимитирующих этапов внутриклеточного
транспорта конструкций. Использование компонентов, дестабилизирующих
везикулярные мембраны и способствующих тем самым выходу конструкций
в цитоплазму, позволяет значительно интенсифицировать рецептор-опосредованную
доставку ДНК. Одними из самых эффективных эндосомолитических агентов
являются аденовирусы. Аденовирусы птиц
(EDS-76
и CELO)
и человека (Ad5 штамм
dl312)
были применены для усиления инсулин-рецептор-опосредованной трансфекции
клеток млекопитающих. Эндосомолитические свойства аденовирусов
тестировали по способности обеспечивать выход кальцеина из липосом.
Исследование рН-зависимости действия аденовирусов на липосомы
показало, что максимальное течение липосом для всех вирусов наблюдалось
при рН 3. CELO и EDS
аденовирусы оказывали полумаксимальное действие при рН 4 и влияли
на течение липосом вплоть до рН 6. Преинкубация аденовирусов при
рН 3 приводила к уменьшению их литической активности. Вирус-содержащие
ДНК-переносящие конструкции собирали путем последовательного добавления
к биотинилированному аденовирусу стрептавидин-полилизина, ДНК
и инсулин-полилизина. Было исследовано влияние аденовируса в комплексе
с полилизином или в составе полной конструкции на течение липосом.
Получены зависимости течения липосом от молярного соотношения
стрептавидин-полилизин/аденовирус и от соотношения лизин/нуклеотид
в конструкции. Вируссодержащие конструкции были использованы для
трансфекции клеток эпителия молочной железы мыши линии НС-11.
Выявлена частичная корреляция литических свойств аденовирусов
в составе конструкций и эффективности экспрессии репортерного
гена в результате трансфекции данными конструкциями. Проведена
работа по оптимизации состава конструкций с целью получения максимального
уровня экспрессии репортерного гена. Наиболее эффективными оказались
конструкции с соотношениями лизин/нуклеотид = 2 и плазмида/аденовирус
порядка 10.